乳酸脱氢酶的测定(LDH)
【答案】：乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶，广泛存在于各组织中，心肌、骨骼肌、肾脏含量最对，其次是肝、胰、脾、肺及肿瘤组织，红细胞内LDH含量为血清的100倍。LDH有五种同工酶，即LDH1-LDH5，LDH1以心肌中含量最多；LDH5YI以骨骼肌含量最多，其次是肝脏、血小板等。
【正常参考值】
血清100～300U/L。
尿560～2050U/L。
脑脊液含量为血清的1/10。
【临床意义】①肝癌尤其是转移性肝癌时LDH显著增高；急性肝炎、慢性肝炎等多数肝胆疾病也常有LDH的增高，且LDH3是诊断肝细胞坏死的敏感指标。肝细胞坏死时LDH5>LDH4，胆道阻塞时LDH4>LDH5；②LDH在急性心肌梗死的8～18小时增高，24～72小时达到高峰，6～10小时恢复正常。此外LDH同工酶LDH1、LDH2在心肌梗死的早期均增高，尤以LDH1的增高更早、更显著，常表现为LDH1>LDH2；③其他：恶性肿瘤时LDH及其同工酶可升高，且肿瘤的增长速度与LDH的增长程度有一定的关系。
乳酸脱氢酶的LDH实验
乳酸脱氢酶（LDH）是催化乳酸和丙酮相互转化的同工酶，属于氢转移酶。该酶存在于所有动物的组织中，在肝脏中活性最高，其次为心脏、骨骼肌、肾脏，在肿瘤组织及白血病细胞中也能检测到。在大多数动物组织中，它是由两种肽链按一定比例组成的5种四聚体。它的每条肽链各由一个基因编码，经转录、翻译、修饰加工等过程，最后成为有生物学活性的物质。不同的动物，不同的组织或器官在不同的发育阶段或不同的生活周期均有其特异性的同工酶酶谱。自然界中存在L和D两种乳酸脱氢酶 。 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗D-LDH抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗D-LDH抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的D-LDH呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板（Assay plate ）：一块（96孔）。2. 标准品（Standard）：2瓶（冻干品）。3. 样品稀释液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。4. 生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。6. 生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）7. 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。9. 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。10. 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。需要而未提供的试剂和器材1. 标准规格酶标仪2. 高速离心机3. 电热恒温培养箱4. 干净的试管和Eppendof管5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器6. 蒸馏水，容量瓶等 实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃，60分钟。3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。 1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。3. 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。7. 底物请避光保存。8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。乳酸脱氢酶偏高怎么办血清中乳酸脱氢酶偏高主要有恶性肿瘤，肝炎、肝硬化等疾病引起的，乳酸脱氢酶检查偏高常见于急性肝炎、阻塞性黄疸、心肌炎、恶性肿瘤、肝硬化、肝癌、运动肌肉营养不良、急性白血病及恶性贫血等病症。临床医学实践表明，80%以上患者体内的血清乳酸脱氢酶升高是由肝脏疾病引起的，尤其是急性乙肝、肝硬化、肝癌等。因此，若患者发现乳酸脱氢酶在血清中的含量不再正常范围之内，应及时到肝病医院进行检测，在医生的指导下进行有针对性的治疗。
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